Leica Biosystems HER2 FISH System - 30 Test - Инструкция (Страница 9)

Стр. 9 из 24
Pу
сский
Leica Biosystems Leica HER2 FISH System - 30 Test Инструкции по использованию TA9217 RU-CE-Rev_D 11/11/2013
Pу
сский
Оценка и подсчет количества сигналов
Для оценки качества сигналов и подсчет количества сигналов HER2 и CEP17 проделайте
следующее:
1. Оценка качества предметных стекол
Оцените качество предметных стекол по следующим критериям:
• Интенсивность сигнала зонда: Сигналы должны быть
отчетливыми и легко оцениваемыми. Сигналы должны иметь либо
отчетливую, компактную овальную, либо растянутую, расплывчатую
овальную форму.
• Фон: Фон должен содержать относительно мало флуоресцентных
частиц и выглядеть темным или черным.
См. Руководство по устранению неисправностей (Taблица 6), если
какая-либо из указанных функций работает неудовлетворительно и при
необходимости повторите анализ.
2. Распознавание заданных сигналов
Убедитесь, что для анализа используются нужные фильтры:
• Обзор ткань: Подсчитывать количество сигналов гибридизации
следует только у клеток инвазивных опухолей. Клетки опухоли
можно отличить от нормальных клеток по размеру: как правило они
крупнее обычных клеток, лимфоцитов и клеток эпителия. Определите
и выберите целевые зоны пятном H&E и пометьте эти зоны на
покровном стекле после выполнения FISH-анализа.
• Глубина фокуса: Отрегулируйте глубину резкости, чтобы определить
глубину фокальной плоскости и узнать форму и размер целевых
сигналов и шума (мусор).
1. Оценка
качества
предметных
стекол
- Интенсивность
сигнала зонда
- Фон
2. Распознава-
ние заданных
сигналов
- Обзор ткань
- Глубина фокуса
3. Пригодность
ядер
- Выбор ядер
3. Пригодность ядер
Обзор гибридизированной области с помощью объектива 20X:
• Выбор ядер: Определите интересующую зону (клетки опухоли,
идентифицированные пятном H&E). Избегайте областей с нечеткими
границами ядер и омертвевшими клетками.
• Кроме того, следует игнорировать сигналы слабой интенсивности и
неопределенный, шумный фон или недостаточное контрпятно для
определения границы ядра. Следует подсчитывать лишь ядра с
дискретными сигналами.
4. Подсчет сигналов
• Обзор опухолей: Просканируйте несколько областей клеток опухоли,
чтобы учесть возможную гетерогенность, с помощью объектива 40X.
Избегайте областей со слабыми сигналами и выберите область с
хорошим распределением ядер.
• Подсчет: Начните анализ в верхнем левом квадранте выбранной
области и, сканируя слева направо, подсчитайте количество
сигналов в рамках границ ядра с помощью объектива 100X согласно
инструкциям, приведенным ниже и на рис. 1.
• Найдите все присутствующие в ядре сигналы, фокусируясь вверх и
вниз (по оси Z).
• Два сигнала одного размера, находящиеся на расстоянии друг от друга
меньшем либо равном диаметру сигнала, считайте как один сигнал.
• Ядра без сигналов или с сигналами только одного цвета не следует
засчитывать. Засчитывайте только ядра с одним или более FISH-
сигналами каждого цвета.
• Подсчитайте количество сигналов HER2 и сигналов CEP17 для
каждого ядра. При необходимости чередуйте разные наборы фильтров
– оранжевый (HER2), зеленый (CEP17), зеленый / оранжевый и DAPI/
зеленый / оранжевый, чтобы увидеть оба цвета.
4. Подсчет
сигналов
- Обзор опухолей
- Подсчет